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石菖蒲提取物及其初步分離物的抑菌活性

發布時間:2010-10-11 11:18:11  瀏覽數:2222  來源:云南永孜堂

石菖蒲提取物及其初步分離物的抑菌活性
鄧業成, 玉艷珍, 王萌萌, 張明, 駱海玉, 覃旭, 李麗芬
(廣西師范大學 生命科學學院; 藥用資源化學與藥物分子工程教育部重點實驗室, 廣西 桂林 541004)
 摘要:采用濾紙片法和帶藥培養基涂布法測定了中藥植物石菖蒲莖和葉甲醇提取物對13種動物病原菌的抑菌活性。結果表明,用帶藥培養基涂布法測定,石菖蒲莖提取物對表皮葡萄球菌、藤黃微球菌、溶壁微球菌、蠟樣芽孢桿菌、痢疾志賀氏菌、傷寒桿菌、巨大芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌9種供試菌有較好的抑菌作用,其最低抑制濃度(MIC值)分別為1.5 g/L2.5 g/L3.5 g/L2.0 g/L1.5 g/L2.5 g/L2.5 g/L3.5 g/L2.5 g/L,對變形桿菌、大腸桿菌、綠膿桿菌和白色念珠菌4種病原菌在樣品濃度為10 g/L時沒有抑菌活性石菖蒲葉提取物的抑菌活性較差,在濃度為10 g/L時,對痢疾志賀氏菌和蠟樣芽孢桿菌在72小時有抑菌活性,對其余供試菌沒有抑菌活性。用濾紙片法測定,結果與用帶藥培養基涂布法基本一致,但抑菌圈較小。采用液-液萃取法對石菖蒲莖提取物的抑菌活性成分進行了初步分離,生測結果表明,1 g/L濃度處理72h正丁醇萃取物9種供試病原菌有抑菌作用,石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和水萃取物沒有抑菌作用,說明石菖蒲的抑菌活性物質主要存在于正丁醇萃取物中。
關鍵詞:石菖蒲;病原菌;抑菌活性;活性物質
 
石菖蒲(Acorus tatarinowii Schott.)為天南星科多年生草本植物,分布于中國黃河以南各省區,印度和泰國等國也有分布。石菖蒲是中國傳統的常用中藥,全株有芳香氣,其味辛、苦,性溫,具有鎮靜和抗驚厥[1-3]、益智 [3-5]及對心血管系統的調節作用 [6-7]。臨床廣泛用于治療健忘、中風失語、耳嗚、老年性癡呆等疑難病癥,其水提液對治療老年癡呆有較好的療效[8]。石菖蒲的化學成分復雜多樣,目前從石菖蒲中分離鑒定出的化學成分主要有單貼類、倍半貼類、二貼類、苯丙素類等揮發油成分及黃酮類、生物堿、糖類、有機酸、氨基酸等非揮發性成分。Chunhui Deng等[9]采用氣-質聯用技術從石菖蒲精油中分離鑒定出32種化學成分;陶宏等[10]和楊曉燕等[11]從石菖蒲的水提取物中共分離出16個化合物。此外,石菖蒲在農藥領域也有多種生物活性和用途。何衍彪等[12]發現石菖蒲提取物對芒果炭疽病菌和香蕉尖孢鐮刀菌有抑制作用;Soon-Okim[13-14]等人研究發現石菖蒲揮發油對米象、綠豆象和煙草甲三種儲糧害蟲表現出很強的抑制活性;姚英娟等[15]發現石菖蒲提取物對玉米象有驅避、__________________________
基金項目:藥用資源化學與藥物分子工程教育部重點實驗室資助項目(桂科能07109001-11);廣西自然科學基金資助項目(桂科自0991097);廣西環境工程與保護評價重點實驗室資助項目(桂科能0702K026)
作者簡介:鄧業成(1965-),廣西全州人,廣西師范大學教授,博士。主要從事天然產物研究。
觸殺和種群抑制作用;謝紅英等[16]報道石菖蒲提取物對粘蟲幼蟲有拒食、毒殺和生長發育抑制作用。可見石菖蒲的生物活性和用途相當廣泛。但是到目前為止,石菖蒲對動物病原菌的抗菌活性尚未有研究和報道。本研究旨在明確石菖蒲對動物病原菌的抗菌活性,為該植物的綜合開發利用提供依據。
   
1 材料與方法
1.1 供試菌種
    表皮葡萄球菌Staphylococcus epidermidis,大腸桿菌Escherichia coli(Migula)Casleillii and Chalmers,藤黃微球菌Micrococcus luteus,綠膿桿菌Pesudomonas aeruginosa(Schroeter) Migula,溶壁微球菌Micrococcus lysodeikticus Fleming,變形桿菌Proteus vulgaris Hauser,蠟樣芽孢桿菌Bacillus cereus Frankland,痢疾志賀氏菌Shigella dysenteriae(Shiga) Castellani and Chalmers,傷寒桿菌Salmonella typhi(Schroeter) Warren and Scott,巨大芽孢桿菌Bacillus megaterium de Bary,金黃色葡萄球菌Staphyloccocus aureus Rosenbach,枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis(Ehrenberg) Cohn,白色念珠菌Monilia albican。上述供試菌由桂林醫學院提供,并用牛肉膏蛋白胨培養基或沙氏培養基進行擴菌后于4℃保存備用。
1.2 供試植物
    石菖蒲(Acorus tatarinowii Schott.):為天南星科(Araceae)菖蒲屬(Acorus)植物,從桂北地區采集。
1.3 試驗方法
1.3.1石菖蒲提取物的制備
    植物材料的提取采用溶劑冷浸法。將采集的石菖蒲莖和葉洗凈泥土和雜質,放在室內通風處晾干,再在60℃恒溫鼓風干燥箱中烘干至發脆,用植物粉碎機粉碎。稱取一定質量的干粉,放入錐形瓶中,加5倍量的甲醇溶劑,在室溫下浸提48 h(其間每隔12 h振搖一次),抽濾。重復2次,將2次濾液合并,用旋轉蒸發儀在水浴中減壓濃縮,蒸干溶劑得膏狀提取物。稱重,密封保存于4℃冰箱中備用。
1.3.2石菖蒲莖甲醇提取物活性物質的初步分離
石菖蒲莖提取物活性物質的初步分離采用液-液萃取法。稱取提取物7g溶于100 mL蒸餾水中,裝入500 mL分液漏斗,依次用等體積的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇進行萃取。每種溶劑萃取3次,合并3次萃取液,減壓濃縮,分別獲得石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物和水萃取物。對各萃取物進行抑菌活性測定,根據抑菌活性大小確定活性物質存在的部位。
1.3.3濾紙片法測定石菖蒲提取物的抑菌活性
參照慕立義的方法[17]并加以改進。先將定性濾紙用直徑為7 mm的打孔器打成小圓片,高壓蒸汽滅菌后,放入濃度為10 g/L的樣品液中浸泡1分鐘,取出晾干備用。取10 mL牛肉膏蛋白胨培養基加到9 cm培養皿中制成培養基平板,取菌懸液0.1 mL加到培養基表面,用涂布器涂布均勻。然后在培養基表面貼上4片浸藥濾紙片和1片未浸藥濾紙片,每處理重復3個培養皿。蓋好皿蓋,置37℃恒溫培養箱中培養24 h,測定并記錄抑菌圈直徑,并計算平均值。
1.3.4用帶藥培養基涂布法測定抑菌活性及最小抑菌濃度MIC
參照慕立義的方法[17]并加以改進。用丙酮和無菌水(1∶1)組成的混合溶劑溶解提取物,配成100 g/L的藥液。在超凈工作臺上取1 mL藥液(對照用混合溶劑代替藥液)與9 mL 牛肉膏蛋白胨熱培養基混勻,倒入直徑為9 cm的玻璃培養皿中,制成厚薄均勻的帶藥培養基。取菌懸液0.1 mL加到培養基表面,用涂布器涂布均勻,置37℃恒溫培養箱中培養。每處理重復3個皿。培養一定時間后觀察記錄菌落的生長情況。測定最小抑菌濃度時,制備系列濃度的帶藥培養基,接菌培養,不長菌的最低濃度即為最小抑菌濃度(MIC)。
 
結果分析
2.1 石菖蒲莖和葉甲醇提取物對13種人和動物病原菌的抑菌活性
分別用濾紙片法和帶藥培養基涂布法測定了石菖蒲莖和葉甲醇提取物對13種人和動物病原菌抑菌活性,結果見表1和表2。用濾紙片法測定,當樣品濃度為10 g/L時,石菖蒲葉提取物對藤黃微球菌、蠟樣芽孢桿菌和痢疾志賀氏菌有抑菌作用,但抑菌圈小,對其余供試菌無抑菌活性;石菖蒲莖提取物除了對大腸桿菌和綠膿桿菌無抑菌作用外,對其余11種供試菌均有不同程度的抑菌活性,對溶壁微球菌、變形桿菌、蠟樣芽孢桿菌、痢疾志賀氏菌和白色念珠菌的抑菌圈相對較大,平均值為0.9 0-1.00 cm,對其他供試菌的抑菌圈較小。
用帶藥培養基涂布法測定,石菖蒲葉提取物在10 g/L時抑菌活性差,除了對痢疾志賀氏菌和蠟樣芽孢桿菌在72小時有抑菌活性,對其余供試菌無抑菌活性;石菖蒲莖提取物對表皮葡萄球菌、藤黃微球菌、溶壁微球菌、蠟樣芽孢桿菌、痢疾志賀氏菌、傷寒桿菌、巨大芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌9種供試菌均有較好的抑菌作用,其MIC值分別為1.5 g/L、2.5 g/L、3.5 g/L、2.0 g/L、1.5 g/L、2.5 g/L、2.5 g/L、3.5 g/L和2.5 g/L,對變形桿菌、大腸桿菌、綠膿桿菌和白色念珠菌在濃度為10 g/L時沒有抑菌作用。
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
表1 石菖蒲莖和葉甲醇提取物對13種人和動物病原菌的抑菌活性(濾紙片法)
供試病原菌
抑菌圈直徑(cm)
表皮葡萄球菌
0.81
0
大腸桿菌
0
0
藤黃微球菌
0.80
0.79
綠膿桿菌
0
0
溶壁微球菌
0.95
0
變形桿菌
0.90
0
蠟樣芽孢桿菌
0.94
0.80
痢疾志賀氏菌
0.87
0.80
傷寒桿菌
0.77
0
巨大芽孢桿菌
0.82
0
金黃色葡萄球菌
0.76
0
枯草芽孢桿菌
0.83
0
白色念珠菌
1.00
0
   
表2 石菖蒲莖和葉甲醇提取物對13種人和動物病原菌的抑菌活性(帶藥培養基涂布法)
供試病原菌
樣品質量濃度(g/L)
10
10
5
4
3.5
3
2.5
2
1.5
1.0
表皮葡萄球菌
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大腸桿菌
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藤黃微球菌
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綠膿桿菌
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溶壁微球菌
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變形桿菌
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蠟樣芽孢桿菌
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痢疾志賀氏菌
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傷寒桿菌
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巨大芽孢桿菌
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金黃色葡萄球菌
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枯草芽孢桿菌
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白色念珠菌
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注:“-”代表不長菌,“+”代表長菌,每個濃度重復3次。
2.2 石菖蒲莖提取物不同萃取物的抑菌活性
采用液-液萃取法對石菖蒲莖甲醇提取物進行活性成分初步分離,得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物和水萃取物4個部分。采用帶藥培養基涂布法測定了各萃取物對9種較敏感的人和動物病原菌的抑菌活性,結果見表3。由表可知,當各萃取物濃度為1 g/L時,正丁醇萃取物對9種病原菌72 h都有抑菌活性;石油醚萃取物和乙酸乙酯萃取物在24 h對大多數病原菌有抑菌活性,48 h沒有抑菌活性;水層沒有抑菌活性。說明石菖蒲的抑菌活性成分主要存在正丁醇萃取物中。
表3 石菖蒲莖提取物的各萃取物對9種病原菌的抑菌活性
菌種
石油醚萃取物
乙酸乙酯萃取物
正丁醇萃取物
水層萃取物
24h
48h
72h
24h
48h
72h
24h
48h
72h
24h
48h
72h
表皮葡萄球菌
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++
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藤黃微球菌
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溶壁微球菌
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蠟樣芽孢桿菌
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痢疾志賀氏菌
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傷寒桿菌
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巨大芽孢桿菌
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金黃色葡萄球菌
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枯草芽孢桿菌
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注:樣品濃度為1g/L;“-”表示不長菌,“+”表示長菌,每個處理重復3次。
 
討論
本研究發現,中藥植物石菖蒲對多種動物病原菌有抑菌活性,表明其作為抗菌中藥有很好的發展前景。植株不同部位的抑菌活性不同,莖的抑菌活性高,葉的抑菌活性低。長期以來都是以石菖蒲莖作為藥材使用,說明莖是主要的藥效部位。石菖蒲對不同的病原菌抑菌活性也不同,對革蘭氏陽性細菌活性好,對革蘭氏陰性菌活性差,如在測定的13種病原菌中,有7種陽性細菌,1種陽性真菌,5種陰性細菌,石菖蒲莖提取物對7種陽性細菌都有較高活性,在5種陰性菌中只對2種陰性細菌有活性,對另外3種陰性細菌和1種陽性真菌在提取物濃度為10 g/L時無活性。這可能與病原菌細胞壁的特性有關,不同細菌胞壁的結構和化學特性不同,從而影響了活性物質進入細胞內部。
采用液-液萃取法對石菖蒲提取物進行了初步分離,分別用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇對提取物的水溶液依次萃取,獲得4部分萃取物,活性測定表明,活性部分為正丁醇萃取物,說明石菖蒲的抑菌活性物質主要存在于正丁醇萃取物中。根據相似相溶原理,活性成分可能是極性較高的化學物質。對其抑菌活性物質的分離純化和結構鑒定有待進一步研究。本文首次報道了石菖蒲對動物病原菌的抑制活性,這對促進其綜合開發利用有十分重要的意義。
  
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Inhibitory activity of traditional Chinese drug plant Acorus tatarinowii Schott. against pathogens of animals
Deng Ye-cheng, Yu Yan-zhen, Wang Meng-meng, Zhang Ming, Luo Hai-yu, Qin Xu, Li Li-feng
(College of Life Science, Guangxi Normal University; Key Laboratory for the Chemistry and Molecular Engineering of Medicinal Resources, Ministry of Educationof China, Guilin 541004, China)
Abstract: The inhibitory activity of the methanol extracts from stems and leaves of traditional Chinese drug plant Acorus tatarinowii Schott. against 13 pathogens of animals was determined using filter paper disk method and culture medium coating method. The results determined by culture medium coating method showed that the extract from the stems had inhibitory activity against Staphylococcus epidermidis, Micrococcus luteus, Micrococcus lysodeikticus1.5 g/L, 2.5 g/L, 3.5 g/L, 2.0 g/L, 1.5 g/L, 2.5 g/L, 2.5 g/L, 3.5 g/L and 2.5 g/L, respectively, and had no inhibitory activity against Proteus vulgaris, Escherichia coli, Pesudomonas aeruginosa and Monilia albican at 10 g/L;, Bacillus cereus, Shigella dysenteriae, Salmonella typhi, Bacillus megaterium, Staphyloccocus aureus and Bacillus subtilis, with the MIC values of extract from leaves exhibited inhibitory activity only against Shigella dysenteriae and Bacillus cereus at 10 g/L after 72 h, and no inhibitory activity against other tested pathogens. The results determined by filter paper disk method was approximately consistent with that determined by culture medium coating method, but the inhibition zone was small. The active ingredients of extract from stems of Acorus tatarinowii Schott. were preliminarily isolated by liquid-liquid extraction, and the inhibitory activity of the isolated petroleum ether extract, ethyl acetate extract, n-butyl alcohol extract and water extract against pathogens was determined. The results indicated that n-butyl alcohol extract had inhibitory activity against the 9 tested pathogens at 1 g/L after 72 h, and other extracts showed no activity, suggesting that the active ingredients of Acorus tatarinowii Schott. mainly exist in n-butyl alcohol extract.
Key words: Acorus tatarinowii Schott.; pathogens; inhibitory activity; active ingredients
 
 

 

 

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